Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала
Для выявления возбудителей заболеваний методом ПЦР
1.1.1. Взятие биоматериала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции.
1.1.2. Количество забранного материала должно быть небольшим. Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.
1.1.3. При внесении биоматериала, взятого у пациента зондом с ватным тампоном или щеточкой, в пробирку типа эппендорф с буферным раствором, необходимо:
Соблюдать стерильность;
Прежде, чем погружать собранный на тампоне (щеточке) биоматериал в раствор, размазать его по сухой стенке пробирки, затем смочить тампон (щеточку) в растворе и, вращая зонд, тщательно смыть весь материал со стенки пробирки и тампона (щеточки);
По возможности отжать тампон о стенку пробирки, удалить зонд с тампоном (щеточкой) и закрыть пробирку.
Способы взятия биоматериала для исследований методом ПЦР
1.2.1. Соскобы. Для соскобов используются одноразовые стерильные зонды, имеющие ватный тампон с повышенной адсорбцией или «щеточки», реже - ложки Фолькмана, малые ушные ложки или аналогичные инструменты со слегка затупленными краями. Поскабливающими движениями собрать материал. Исследуемый материал должен содержать возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи, примесей крови и экссудата. Внести материал в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).
Соскоб из цервикального канала: перед взятием соскоба необходимо удалить избыток слизи стерильным ватным тампоном, обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором. Зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, избегая соприкосновения со стенками влагалища, и поскабливающим движением (не до крови) собрать материал. Небольшое количество эритроцитов в пробе не влияет на результат анализа. При наличии эрозии шейки матки материал берут с границы здоровой и измененной ткани.
Соскоб из уретры: зонд ввести в уретру (у мужчин - на глубину 2-4 см) и несколькими вращательными движениямисобрать материал. Накануне перед взятием материала допускается провокация (острая пища, алкоголь и др.). Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1-2-х часов перед взятием пробы. При наличии обильных гнойных выделений соскоб надо брать не позже, чем через 15 минут после мочеиспускания.
Соскоб с конъюнктивы берут, предварительно проведя анестезию глаза 0,5% раствором дикаина. Вывернув веко, зондом с ватным тампоном (либо глазным скальпелем) собрать эпителиальные клетки с конъюнктивы.
Соскоб из прямой кишки: зонд ввести в анальное отверстие на глубину 3-4 см и вращательным движением собрать материал.
1.2.2. Мазки. Одноразовым стерильным зондом с ватным тампоном или щеточкой взять небольшое количество отделяемого (со сводов влагалища, из зева, носоглотки и др.) и перенести в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).
1.2.3. Кровь. Для исследований методом ПЦР кровь должна быть нативной (не свернувшейся).
Кровь собрать асептически, путем венопункции - в фирменную пробирку (2-3 мл) с антикоагулянтом ЭДТА (гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! ), аккуратно перемешать, плавно переворачивая пробирку.
Кровь с ЭДТА является биоматериалом для следующих групп исследований:
- генетические исследования (момент забора крови значения не имеет).
- выявление возбудителей инфекций (наиболее информативными являются пробы, взятые при ознобе, повышенной температуре, т. е. предположительно во время виремии или бактериемии).
1.2.4. Моча. В пустой стерильный контейнер с плотно завинчивающейся крышкой собирают утреннюю первую или среднюю порцию мочи в количестве минимум 10 мл. Если забор мочи проводят днем, то перед этим пациент не должен мочиться 1,5-3 часа.
1.2.5. Мокрота. Утром провести санацию ротовой полости и горла (прополоскать раствором питьевой соды). Собрать мокроту в пустой стерильный широкогорлый флакон.
1.2.6. Биоптат. Взятие материала осуществлять из зоны предполагаемого местонахождения возбудителя инфекции, из поврежденной ткани или пограничного с повреждением участка. Поместить биоптат в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.
1.2.7. Слюна, желудочный сок, ликвор, синовиальная жидкость. Слюна (1-5 мл), желудочный сок (1-5 мл), ликвор (1-1,5 мл) - поместить в пустую стерильную пробирку (контейнер).
1.2.8. Сок предстательной железы. После массажа предстательной железы сок собирают в количестве 0,5-1 мл в пустую стерильную пробирку (контейнер). При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи в количестве не более 10 мл (в этой порции содержится сок предстательной железы).
1.2.9. Смывы, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Стерильным ватным тампоном и 5-7 мл физиологического раствора проводят смыв, например, с наконечника эндоскопа или бронхоскопа, и помещают 0,5-5 мл смыва в пустую стерильную пробирку (контейнер).
1.2.10. Фекалии. Зонд с ватным тампоном помещают внутрь каловых масс и слегка проворачивают, захватывая небольшое количество материала. Затем материал помещают в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.
Решение о необходимости исследовать ту или иную локализацию (влагалище, уретра, цервикальный канал и др.) для анализа принимает лечащий врач на основании совокупности жалоб пациентки (та) и клинической картины заболевания.Для получения объективного результата необходимо, чтобы исследуемый клинический материал содержал возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи и примеси крови (допустимо умеренное присутствие примесей в виде крови и слизи). Неправильное взятие биоматериала может привести к невозможности получения достоверного результата и, вследствие этого, необходимости повторного взятия биоматериала.Порядок взятия клинического материала в пробирку с транспортной средой:
1. Открыть крышку пробирки.
2. С помощью одноразового стерильного зонда получить отделяемое соответствующего
биотопа (влагалище, уретра, цервикальный канал).
3.Перенести зонд с клиническим материалом в пробирку с транспортной средой объемом 1,5 мл, когда зонд упрется в дно пробирки, дополнительным усилием согнуть тонкую часть зонда до насечки, затем отломить и оставить зонд в пробирке.При необходимости получения клинического материала из нескольких биотопов повторить процедуру, каждый раз забирая клинический материал новым зондом в новую пробирку.
3. Пробирку плотно закрыть крышкой, промаркировать.
Особенности взятия клинического материала цервикального канала:
1.Клинический материал цервикального канала получают после введения во влагалище гинекологического зеркала с помощью уретрального зонда или цервикальной цитощетки (для исследования на ВПЧ необходимо достаточное количество эпителиальных клеток!).
2.Перед взятием клинического материала необходимо тщательно обработать отверстие цервикального канала с помощью стерильного марлевого тампона и затем обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором.
3.После введения уретрального зонда в шеечный канал на 1,5 см его вращают несколько раз (2-3 полных оборота по часовой стрелке) и извлекают. При извлечении зонда необходимо полностью исключить его касание стенок влагалища.
4. Полученный клинический материал помещается в пробирку с транспортной средой (см. выше).
Особенности взятия клинического материала из влагалища:
В день обследования женщины не должны проводить туалет половых органов и спринцевание влагалища.
1. Клинический материал из влагалища получают с заднего или боковых сводов с помощью вагинального или уретрального зонда путем соскоба с поверхности эпителия.
2. Клинический материал должен быть получен ДО проведения мануального исследования.
3. Перед манипуляцией гинекологическое зеркало можно смочить теплой водой, применение антисептиков для обработки зеркала противопоказано.
4. У девочек (virgo) клинический материал получают со слизистой оболочки преддверия влагалища без использования гинекологического зеркала.
5. Полученный клинический материал помещается в пробирку с транспортной средой (см. выше).
Особенности взятия клинического материала из уретры у женщин:
1. Клинический материал из уретры получают с помощью уретрального зонда.
2.Перед взятием клинического материала пациентке рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1,5-2 часов.
3. При наличии свободных уретральных выделений наружное отверстие уретры следует очистить с помощью ватного тампона.
4. При отсутствии свободных выделений может быть проведен легкий массаж уретры.
5. После введения инструмента в уретру на глубину 1 см необходимо продвигать его к наружному отверстию, слегка нажимая на заднюю и боковые стенки уретры (вращательные движения болезненны).
6. Полученный клинический материал помещается в пробирку с транспортной средой(см. выше).
Для исследования материала,полученного из нескольких биотопов, процедуру повторяют, каждый раз используя новый стерильный зонд и новую пробирку!!!
Недопустимо смешивать материал из цервикального канала, влагалищного содержимого и уретры в одной пробирке!
Особенности взятия клинического материала из уретры у мужчин:
1,5–2 часов. Для исключения искажений результатов определения состава микрофлоры урогенитального тракта мужчин из-за присутствия в урогенитальном тракте транзиторной микрофлоры в течение трёх дней перед взятием биоматериала рекомендуется половое воздержание или использование защищенного полового контакта.
1.Перед взятием соскоба из уретры обрабатывают головку полового члена в области наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором.
2.Производят массаж уретры. При наличии свободно стекающих из уретры выделений удаляют их сухим тампоном.
3.Вводят зонд в уретру на глубину 1-2 см. Несколькими вращательными движениями производят соскоб эпителиальных клеток и переносят зонд в пробирку с транспортной средой, обламывают и оставляют. Отделяемое забирают в достаточном количестве. Допустимо умеренное присутствие примесей в виде слизи, крови и гноя.
Взятия клинического материала с крайней плоти головки полового члена (ГПЧ):
Перед взятием биоматериала пациенту рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение
1,5–2 часов.
1.С помощью одноразового зонда делают соскоб эпителиальных клеток из соответствующего биотопа (крайняя плоть головки полового члена, препуциальный мешок) и переносят зонд в пробирку с транспортной средой, обламывают и оставляют.
Условия хранения и транспортировки биоматериала:
1. Пробирки с полученным клиническим материалом должны быть промаркированы.
2. В сопроводительном документе-направлении необходимо указать: ФИО, возраст пациентки (та), клинический материал, предполагаемый диагноз, показания к обследованию, дату и время взятия пробы, наименование учреждения (подразделения), направляющего клинический материал.
3. Если время транспортировки клинического материала от момента взятия до момента его доставки в лабораторию не более суток, то пробирку с клиническим материалом необходимо хранить и доставлять в лабораторию при температуре бытового холодильника (+ 4+10°С), не замораживая.
4. В случае невозможности доставки клинического образца в лабораторию в течение суток, допускается однократное замораживание и хранение образца клинического материала при температуре -20°С до одного месяца.УРОГЕНИТАЛЬНЫЙ ХЛАМИДИОЗ
Материал для исследования Соскоб из уретры или цервикального канала, секрет предстательной железы, осадок мочи. У новорожденных в качестве материала для исследования используют соскоб с конъюктивы глаз и задней стенки глотки. У девочек в качестве материала для исследования используют соскоб из вульвы, у мальчиков - мочу.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры.
Особенности взятия материала из уретры
- перед взятием материала пациенту рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1,5-2 часов;
- непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры необходимо обработать тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором;
- при наличии гнойных выделений соскоб рекомендуется брать через 15-20 мин после мочеиспускания, при отсутствии выделений необходимо провести массаж уретры с помощью зонда для взятия материала;
- у женщин перед введением зонда в уретру проводится ее массаж о лобковое сочленение;
- в уретру у женщин зонд вводится на глубину 1,0-1,5 см, у мужчин - на 3-4 см и затем делается несколько вращательных движений; у детей материал для исследования берут только с наружного отверстия уретры;
Особенности взятия материала из цервикального канала
- перед взятием материала необходимо удалить ватным тампоном слизь и затем обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором;
- зонд вводится в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см;
- при наличии эрозий цервикального канала необходимо их обработать стерильным физиологическим раствором, и материал следует брать на границе здоровой и измененной ткани;
- при извлечении зонда необходимо полностью исключить его касание со стенками влагалища;
После взятия материала зонд опускается в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После внесения зонда в транспортную среду он несколоко раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Про-бирка закрывается и маркируется. Если время транспортировки биологического материала с момента взя-тия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -20 0 С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
Особенности взятия секрета предстательной железы
Перед взятием секрета простаты головка полового члена обрабатывается стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором. Секрет простаты берется после предварительного массажа простаты через прямую кишку. Врач проводит массаж с надавливанием несколькими энергичными движениями от основания к верхушке. Затем из кавернозной части выдавливается простатитческий секрет. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике.
Особенности взятия (сбора) мочи
Мочу собирают утром натощак после сна или не ранее чем через 2-3 часа после последнего мочеиспускания. Утренняя моча отстаивается в течение 1 часа, затем осторожно сливается, оставляя только придонную часть - около 10 мл. Этот остаток сливают в центрифужную пробирку и центрифугируют. Затем надосадочную жидкость вновь сливают, а осадок (без жидкости) зондом переносят в пробирку для ПЦР.
До получения осадка мочу нельзя охлаждать или замораживать.
Особенности взятия материала с задней стенки глотки
Одноразовый зонд вводят за мягкое небо в носоглотку и проводят по задней стенке глотки. После взятия материала зонд опускается в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После внесения зонда в транспортную среду он несколоко раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Пробирка закрывается и маркируется. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -200С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
Особенности взятия материала с конъюктивы глаз
При наличии обильного гнойного отделяемого его убирают стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором. Соскоб берут с внутренней поверхности нижнего века движением к внутреннему углу глазной щели. При взятии соскоба необходимо придерживать веко руками, чтобы при моргании ресницы не касались зонда.
После взятия материала зонд опускается в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После внесения зонда в транспортную среду он несколоко раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Пробирка плотно закрывается. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -200С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
УРОГЕНИТАЛЬНЫЙ МИКОПЛАЗМОЗ
Материал для исследования Отделяемое уретры, влагалища, цервикального канала, моча (центрифугат утренней первой и средней порций), секрет простаты, сперма.
Особенности взятия материала из влагалища
Материал должен быть взят до проведения мануального исследования. Зеркало перед манипуляцией можно смочить горячей водой, применение антисептиков для обработки зеркала противопоказано. Влагалищное отделяемое собирают стерильным одноразовым зондом из заднего нижнего свода или с патологически измененных участков слизистой и помещают в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСТПЕСС”. У девочек взятие материала производят со слизистой оболочки преддверия влагалища, а в отдельных случаях - из заднего свода влагалища через гименальные кольца. После внесения зонда в транспортную среду он несколоко раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Пробирка закрывается и маркируется. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -200С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
ГОНОРЕЯ
Материал для исследования Отделяемое уретры, цервикального канала, секрет предстательной железы, осадок мочи.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки См. урогенитальный хламидиоз.
За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Материал для исследования у женщин следует брать перед менструацией или через 1-2 дня после ее окончания. Перед взятием материала необходимо воздержаться от мочеиспускания в течение 3-4 часов и половых сношений. Женщины накануне обследования не должны проводить туалет наружных половых органов и спринцевание. Исследуемый материал должен быть без примесей крови. Не следует для исследования брать свободно стекающие уретральные выделения. Секрет простаты следует брать только после окончания острых явлений простатита. При вялотекущей и хронической гонорее перед исследованием необходимо провести провокацию.
Методы провокации при гонорее:
- биологическая: введение гоновакцины (500 млн. микробных тел) взрослым однократно, внутримышечно, детям старше 3-х лет - 100-200 млн. микробных тел; детям до 3-х лет введение гоновакцины не рекомендовано;
- термическая: применение в течение 3-х дней диатермии с абдоминально-вагинально-сакральным расположением электродов по 30, 40, 50 мин или индуктотермии по 10, 15, 20 мин; взятие материала лучше всего провводить из уретры, цервикального канала через 1 час после каждого прогревания;
- механическая: наложение металлического колпачка на шейку матки женщин на 4 часа, проведение массажа уретры у мужчин на буже в течение 10 мин;
- алиментарная: употребление соленой, острой пищи и алкоголя за 24 часа до исследования.
Взятие материала производится после провокации и через 24-48-72 часа.
Для получения наиболее достоверных результатов необходимо проведение повторных исследований.
ТРИХОМОНИАЗ
Материал для исследования Отделяемое из уретры (у мужчин), влагалища, секрет простаты.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки См. урогенитальный хламидиоз, урогенитальный микоплазмоз.
ТУБЕРКУЛЕЗ (внелегочные локализации)
Материал для исследования Моча, мазки из цервикального канала, уретры.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. См. урогенитальный хламидиоз.
ЗАБОЛЕВАНИЯ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ АССОЦИИРОВАННЫЕ С Mycoplasma pneumoniae
Материал для исследования Мазок из носоглотки.
Особенности взятия мазка из носоглотки Взятие мазка проводится натощак или не ранее, чем через 2-4 часа после еды. При взятии материала необходимо хорошее освещение, пациент сидит против источника света, корень языка придавливают шпателем, материал берут стерильным зондом, не касаясь языка, слизистой щек и зубов и опускают в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После взятия материала зонд опускается в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После внесения зонда в транспортную среду он несколько раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Пробирка закрывается. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -200С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ (гастрит, язвенная болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки), АССОЦИИРОВАННЫЕ С Helicobacter pylori
Материал для исследования Биоптаты антрального отдела желудка, биоптаты двенадцатиперстной кишки, биоптаты десен, мазки из зубодесневого кармана.
Особенности взятия биопсийного материала
Взятие биопсийного материала проводится во время эндоскопического исследования. Перед началом противохеликобактерной терапии биопсийный образец берется из антрального отдела желудка. При контроле лечения взятие биопсийного образца проводится не ранее чем через 4 недели после проведения противохеликобактерной терапии из тела желудка. Взятый биопсийный образец опускается в стерильную сухую пробирку (эппендорф) и немедленно доставляется в лабораторию. Для более длительного хранения возможна заморозка взятиго биопсийного материала при температуре -20 0 С.
Особенности взятия биоптатов десен, мазков из зубодесневого кармана и слюны
Биопсийный материал из десен, мазки из зубодесневого кармана и слюна берутся у пациентов с гастродуоденальной патологией в анамнезе при наличии у них гингивитов и парадонтоза.
Взятый биопсийный образец опускается в стерильную сухую пробирку (эппендорф) и немедленно доставляется в лабораторию. Для более длительного хранения возможна заморозка взятиго биопсийного материала при температуре -20 0 С.
Мазки из зубодесневого кармана собираются в стерильную пробирку (эппендорф) с физиологическим раствором. В этом случае пробирки могут храниться в холодильнике (+4 0 С- +6 0 С) не более 12 часов, а их транспортировка осуществляется в сумке-холодильнике.
ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ
Herpes Simplex virus II; Citomegalovirus; H. papiloma virus 16, 18
Исследуемый материал- мазки
При герпетической инфекции соскобы лучше всего брать с генитальных поражений (везикул, язвочек). При отсутствии генитальных поражений соскоб берется из цервикального канала. При диагностике цитомегаловирусной инфекции материалом для исследования могут быть, мазок из задней стенки глотки, соскобы из влагалища, уретры и цервикального канала, слюна, спиномозговая жидкость. При диагностике папилломавирусной инфекции материалом для исследования могут быть мазок из носоглотки, с конъюктивы глаза, соскоб из цервикального канала, шейки матки, т.е. слизистых (неороговевабщий эпителий).
Взятие биологического материала Взятие биологического материала повозможности должно проводиться в период обострения инфекции. См. урогенитальный хламидиоз, урогенитальный микоплазмоз.
Herpes Simplex virus I; Herpes Simplex virus II; Herpes Simplex virus VI
Citomegalovirus; Epstein Barr virus
Исследуемый материал Нативная кровь.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки Кровь на исследование желательно брать натощак.
Венозная кровь в количестве 1-1,5 мл отбирается в стерильную пробирку (эппендорф) объемом 1,5 мл с раствором ЭДТА. Пробирка с кровью может храниться в холодильнике (+4 0 С- +6 0 С) не более 24 часов. Пробирку не замораживать. Исследование будет проводиться из плазмы и форменных элементов крови.
HBV-ДНК; Определение концентрации HBV-ДНК методом конкурентной ПЦР
HCV-РНК (полуколич. оценка) + anti-HCV; HCV-РНК с определением генотипа HCV+ anti-HCV; Hepatitis G; TTV-ДНК
Исследуемый материал Сыворотка крови.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки Взятие венозной крови и приготовление сыворотки см. в разделе определение концентрации гомонов методом ИФА. Исследованию подлежит cыворотка, не содержащая примеси эритроцитов. В случае необходимости длительного хранения исследуемого образца крови (только для гепатитов B, C, G) необходимо отобрать 1 мл сыворотки или плазмы крови и хранить ее при температуре -20 0 С не более 2-х недель.
КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ
Исследуемый материал Мазки из заднего нижнего свода влагалища.
Для комплексной диагностики бактериального вагиноза необходимо:
Взять соскоб эпителиальных клеток из заднего или бокового свода влагалища на отдельное одноразоаое предметное стекло, подписать и высушить его. Хранить стекло при комнатной температуре.
Удалить слизь и взять соскоб эпителиальных клеток из заднего или бокового свода влагалища одноразовым зондомщеткой типа цервикс-браш в ПЦР-пробирку с реактивом “ДНК-ЭКСПРЕСС”. Хранить пробирку в морозильной камере при температуре минус 20оС до 10 дней.
Предметное стекло и ПЦР-пробирку отправить в лабораторию “Литех” с полностью заполненным направлением.
Взятие биологического материала и условия его транспортировки
См. особенности взятия материала из влагалища для цитологического и ПЦР исследований.
Оптимальное время исследования крови – в интервале от 1 до 4 часов после взятия.В промежутке от 5 до 30 минут происходит временная адаптации тромбоцитов к антикоагулянту и их агрегация, что может привести к их ложному снижению в пробе крови.
Нежелательно исследовать кровь позднее 8 часов после взятия, т.к. изменяются некоторые характеристики клеток: снижается объем лейкоцитов, повышается объем эритроцитов, что в конечном итоге приводит к ошибочным результатам измерения и неправильной интерпретации результатов. Только концентрация гемоглобина и количество тромбоцитов остаются стабильными в течение суток хранения крови.
Кровь нельзя замораживать. Капиллярную кровь с К 2 ЭДТА следует хранить при комнатной температуре и анализировать в течение 4 часов после взятия.
При необходимости проведения отсроченного анализа (транспортировка на отдаленные расстояния, техническая неполадка прибора и т. д.), пробы крови хранят в холодильнике (4 о – 8 о С) и исследуют в течение 24 часов. Однако при этом следует учитывать, что происходит набухание клеток и изменение параметров, связанных с их объемом. У практически здоровых людей эти изменения не носят критического характера и не сказываются на количественных параметрах, но при наличии патологических клеток, последние могут изменяться или даже разрушаться в течение нескольких часов с момента взятия крови.
Непосредственно перед исследованием кровь должна быть тщательно перемешана в течение нескольких минут для разведения антикоагулянта и равномерного распределения форменных элементов в плазме. Длительное постоянное перемешивание образцов до момента их исследований не рекомендуется вследствие возможного травмирования и распада патологических клеток.
Исследование крови на автоматическом анализаторе проводится при комнатной температуре. Кровь, хранившуюся в холодильнике, необходимо вначале согреть до комнатной температуры, так как при низкой температуре увеличивается вязкость крови, и форменные элементы имеют тенденцию к склеиванию, что в свою очередь, приводит к нарушению перемешивания и неполному лизису. Исследование холодной крови может быть причиной появления «сигналов тревоги» вследствие компрессии лейкоцитарной гистограммы.
При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Воздействие механических факторов (тряска, вибрация, перемешивание и т.д.), температурного режима, вероятность пролива и загрязнения проб могут оказывать влияние на качество анализов. Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично закрытые пластиковые пробирки и специальные транспортные изотермические контейнеры. Во время транспортировки не допускается контакт образца (с нативным материалом) и бланка-направления, в соответствии с правилами биологической безопасности.
^ 4.3. Прием и регистрация биологического материала
Пробирки с образцами венозной крови доставляют в лабораторию в день взятия в в штативах в специальных сумках-саквояжах для доставки биологического материала, в которых пробирки должны находиться в вертикальном положении, а при транспортировке на удаленное расстояние - в специальных контейнерах.
Сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить:
Правильность оформления направления: в бланке–направлении указываются данные обследуемого (фамилия, имя и отчество, возраст, № истории болезни или амбулаторной карты, отделение, диагноз, проведенная терапия);
Маркировку пробирок с образцами крови (на них должны быть нанесены код или фамилия больного, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для исследования). Лаборант должензарегистрировать доставленный материал, отметить количество пробирок.
^ 4.4 Подсчет клеточного состава крови на гематологическом анализаторе
Подсчет клеточного состава крови на гематологическом анализаторе должен проводиться в строгом соответствии с инструкцией к прибору.
При работе на гематологическом анализаторе следует:
Использовать кровь, стабилизированную К- 2 ЭДТА в рекомендованной пропорции для конкретной соли и одноразовые пробирки для гематологических исследований (простых или вакуумных);
Перед анализом осторожно, но тщательно перемешать пробирку с кровью (рекомендуется для этой цели использовать устройство для перемешивания образцов крови - ротомикс);
Использовать реактивы, зарегистрированные в установленном порядке; при смене реактивов на продукцию другого производителя следует проверить и установить калибровку прибора;
Запускать прибор, соблюдая все стадии промывки, добиваясь нулевых (фоновых) значений показателей по всем каналам;
Обращать внимание на сообщения прибора о вероятных систематических ошибках: помнить, что увеличение МСНС выше нормальных значений, как правило, результат ошибки измерения;
При выявлении ошибки обязательно устранить причину, не работать на неисправном приборе;
Выполнять процедуру контроля качества по соответствующей программе. с оценкой полученного результата;
Работать осмысленно, сопоставляя получаемые результаты с клинической характеристикой проб больного;
После окончания измерений тщательно промыть анализатор;
При остановке прибора на длительный срок обязательно выполнить все процедуры консервации (по возможности совместно с сервис-инженером);
При возникновении технических проблем следует воспользоваться помощью сервис-инженера фирмы, имеющей лицензию на техническое обслуживание; не доверять работу необученному персоналу.
Приступая к работе на гематологическом анализаторе, следует учесть границы линейности измерения анализируемых параметров. Оценка проб со значениями анализируемых параметров, превышающих границу линейности измерения, может привести к ошибочным результатам. В большинстве случаев при анализе проб с гиперцитозами анализатор вместо значения измеряемого параметра выдает значок "D" (dilute), что указывает на необходимость разведения пробы и повторного измерения. Разведение необходимо проводить до тех пор, пока не будут получены схожие итоговые результаты при двух ближайших разведениях.
^ П р и м е р ─ Анализ пробы больного с гиперлейкоцитозом на трех различных гематологических анализаторах представлен в таблице.
Таблица 3
¦Результаты подсчета количества при гиперлейкоцитозе, выполненные на трех различных гематологических анализаторах
| ^ Гематологические анализаторы | Степень разведения пробы | Итоговое значение |
|||
| ^ Цельная кровь | 1:1 | 1:3 | 1:4 | WBC |
|
| 1 | D | 274,5 | 274,5 | 143,1 | 715,5 |
| 2 | 322,6 | 253,2 | 177,7 | 141,8 | 709,0 |
| 3 | D | D | 168,3 | 139,1 | 695,5 |
Из таблицы видно, что при анализе цельной крови только один анализатор (2-й) дал цифровое значение количества лейкоцитов, два других указали на необходимость разведения пробы. Последующее поэтапное измерение пробы в трех разведениях позволило добиться близких конечных результатов на всех приборах только при разведении 1:3 и 1:4. Таким образом, итоговое количество лейкоцитов составило 700,0 - 710,0 x 10 9 /л, что более чем в 2 раза превышает первоначальное значение, полученное в цельной крови на 2-м анализаторе и в 1,5 - при разведении 1:1 на 1-м и 2-м анализаторах.
^ Калибровка гематологических анализаторов
Которой достигается равенство нулю систематической составляющей погрешности (нулевое смещение) или подтверждается, что смещение равно нулю с учетом погрешности калибровки. Калибровка гематологических анализаторов может быть выполнена двумя основными способами:
По цельной крови;
По образцам стабилизированной крови с аттестованными значениями.
^ 5.1 Калибровка по цельной крови
Калибровка по цельной крови может быть выполнена путем сравнения с референтным анализатором, калибровка которого верифицирована и может быть принята за исходную.
Для калибровки путем сравнения с референтным анализатором используется 20 образцов венозной крови пациентов, выбранных произвольно из дневной программы исследований лаборатории, располагающей референтным анализатором. Кровь должна быть взята в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К 2 ЭДТА. После анализа на референтном анализаторе пробирки с кровью доставляются лабораторию для анализа на калибруемом приборе. Время между измерениями на референтном и калибруемом анализаторе не должно превышать 4 часа. Анализ калибровочных проб на калибруемом приборе должен выполняться таким же способом, как и анализ проб пациентов. Полученные результаты заносятся в таблицу по форме, приведенной в Приложении 1. Данные результаты используются для определения соответствующих калибровочных факторов, которые численно равны коэффициентам наклона калибровочных прямых, проходящих на графике через начало координат.
Калибровочные факторы рассчитываются на компьютере с использованием программы EXCEL, входящей в состав пакета Microsoft OFFICE любой версии. Для расчета калибровочных факторов в данной программе строится точечная диаграмма, где по оси Х откладываются измеренные значения, по оси Y – референтные, задается линия регрессии через начало координат. Программа рисует калибровочную прямую и определяет ее наклон, который и является искомым калибровочным фактором. При выявлении грубых ошибок – точек значительно отстоящих на графике от калибровочной прямой, их необходимо удалить из расчета (стереть всю строку в таблице EXCEL). Полученный калибровочный фактор заносится в таблицу Приложения 1 и используется для ручной корректировки калибровки прибора в соответствие с его инструкцией по эксплуатации.
^ Калибровка по образцам стабилизированной крови с аттестованными значениями
Во всех случаях, когда возможно, следует использовать калибраторы, специально предназначенные изготовителем для калибровки конкретного типа анализатора. Погрешности установленных значений в современных гематологических калибраторах в основном соответствуют медицинским требованиям. Однако не для всех типов анализаторов такие калибраторы имеются. Кроме того, ввиду ограниченного срока сохранности (как правило, не более 45 дней) не всегда имеется возможность получать непросроченные образцы.
Контрольные материалы не предназначены изготовителем для целей калибровки: допуски для значений значительно шире, методы аттестации и производственного контроля не такие строгие как для калибраторов. При проведении калибровки, контрольные материалы могут быть использованы лишь как один из источников информации о метрологических свойствах прибора.
Следует, однако, иметь ввиду, что при использовании для целей калибровки как контрольных материалов, так и калибраторов, особенности пробоподготовки и эксплуатации анализаторов оказывают существенное влияние на составляющие систематической погрешности. Данные влияющие факторы не могут быть учтены при калибровке коммерческими материалами. Вследствие этого, во всех случаях, проведенная калибровка должна быть верифицирована путем анализа статистики получаемых результатов в пробах пациентов (эритроцитарные индексы, интервалы нормальных значений).
5.2.1 Периодичность калибровки гематологических анализаторов
Требования к периодичности калибровки обычно содержатся в инструкции по эксплуатации анализатора. Как правило, калибровка требуется после ремонта или в случае выявления значимого дрейфа в процедурах внутрилабораторного контроля качества.
5.2.2 Процедура калибровки
Процедура калибровки выполняется в соответствии с инструкцией по эксплуатации анализатора.
5.2.3 Контроль результата калибровки
Данный контроль заключается в анализе калибровочного образца сразу после выполнения калибровки. Выполненная калибровка принимается, если результаты анализа соответствуют калибровочным значениям с учетом аналитической вариации анализатора.
5.2.4 Верификация калибровки с помощью эритроцитарных индексов
В этом способе проверки и уточнения калибровки используется тот факт, что средние значения эритроцитарных индексов – МСНС, МСН и MCV по пациентам имеют довольно малую вариацию и поэтому могут эффективно использоваться для контроля калибровки и дальнейшего контроля качества. Рекомендуемое число проб для усреднения равняется 20. Для определения среднего значения МСНС могут быть использованы любые пробы пациентов, в то время, как для определения средних МСН и MCV следует исключать пациентов с анемиями.
Многие современные гематологические анализаторы имеют встроенные программы расчета текущих средних, что значительно облегчает обработку данных.
Целевые значения эритроцитарных индексов при усреднении по 20 пробам пациентов в возрасте от 18 до 60 лет независимо от пола приведены в таблице 4.
Таблица 4
Целевые значения эритроцитарных индексов
Если полученные средние значения вышли за контрольный допуск, то это означает, что калибровка MCV или Hgb или RBC нуждается в корректировки.
При выяснении причин неудовлетворительной калибровки по результатам исследования эритроцитарных параметров при использовании коммерческих калибровочных/контрольных материалов следует принимать во внимание следующую оценку надежности аттестованных значений материалов:
Наиболее точным и стабильным во времени параметром является концентрация эритроцитов;
Стабильным параметром является Hgb, но он может зависеть от применяемых реактивов (например, циановые или бесциановые);
Самым нестабильным параметром является MCV. Значение MCV имеет тенденцию к изменению в течение всего срока годности материала в довольно широком интервале значений. При уточнении калибровки по MCV данные, полученные из анализа средних по эритроцитарным индексам, имеют приоритет над аттестованными значениями в образцах стабилизированной крови.
Считая калибровку по RBC правильной, в таблице 5 указаны возможные причины выхода средних значений индексов за контрольный допуск.
Таблица 5
Причины выхода за пределы средних значений эритроцитарных индексов
| Эритро-цитарные индексы | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса |
| MCHC | Ниже границы | Выше границы | Выше границы | Ниже границы |
| MCH | В границах допуска | В границах допуска | Выше границы | Ниже границы |
| MCV | Выше границы | Ниже границы | В границах допуска | В границах допуска |
| Причина | Завышен MCV | Занижен MCV | Завышен Hgb | Занижен Hgb |
Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом ФПК и ПК
Перечень разделов по дисциплине клиническая лабораторная диагностика для подготовки к выполнению аудиторных контрольных работ в зимнюю лабораторно-экзаменационную сессию студентами 6 курса заочной формы обучения.
1. Организационная структура клинико-диагностической лаборатории.
2. Общеклинические лабораторные исследования.
3. Гематологические лабораторные исследования.
4. Лабораторные методы оценки гемостаза.
5. Биохимические лабораторные исследования.
6. Контроль качества лабораторных исследований.
Перечень контрольных вопросов по дисциплине клиническая лабораторная диагностика для подготовки к выполнению аудиторных контрольных работ в зимнюю лабораторно-экзаменационную сессию студентами 6 курса заочной формы обучения.
Структурная организация клинико-диагностической лаборатории.
Нормативные документы и приказы МЗ РБ, регламентирующие работу клинико-диагностической лаборатории.
Оборудование клинико-диагностической лаборатории.
Основная измерительная и аналитическая аппаратура клинико-диагностической лаборатории.
Основы техники безопасности и правила санэпидрежима при работе в клинико-диагностической лаборатории.
Правила взятия, доставки, приема, оформления и регистрации биологического материала.
Общеклинические лабораторные исследования.
Подготовка пациента к исследованию, сбор, хранение и обработка материала для общего анализа мочи.
Физические свойства мочи: цвет, прозрачность, запах, рН, относительная плотность мочи.
Химические свойства мочи, методы определения общего белка (качественный и количественный методы, методы «сухой химии»).
Определение глюкозы в моче при помощи индикаторной бумаги и глюкозооксидазным методом.
Правила приготовления нативного препарата мочевого осадка.
Количественное определение элементов организованного осадка мочи.
Определение элементов неорганизованного осадка.
Виды неорганизованных осадков.
Общий клинический анализ крови.
Характеристика методов определения СОЭ, концентрации гемоглобина, подсчета количества эритроцитов, цветового показателя, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы.
Правила подготовки пациента, забор, хранение и обработка материала для общего клинического анализа крови.
Нормальные значения и пределы физиологических колебаний уровня эритроцитов и лейкоцитов периферической крови.
Правила приготовления препарата и подсчета в камере Горяева.
Метод определения гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом.
Современное представление о костно-мозговом кроветворении.
Процентное содержание лейкоцитов в периферической крови. Диагностическое значение лейкоцитарной формулы.
Лабораторные исследования, характеризующие свертывающую систему крови.
Понятие о системе свертывания крови.
Первичный гемостаз. Лабораторные методы исследования первичного гемостаза.
Фазы коагуляционного гемостаза.
Фибринолиз.
Антикоагулянтная система.
Лабораторные методы оценки вторичного гемостаза.
Лабораторные исследования, характеризующие биохимические показатели крови.
Лабораторные показатели, характеризующие белковый обмен. Определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом.
Остаточный азот и его компоненты. Методы определения мочевины, креатинина, мочевой кислоты.
Методы исследования ферментов. Клинико-диагностическое значение определения активности ферментов.
Биологическая роль углеводов. Определение содержания глюкозы ферментативным методом.
Липопротеины плазмы крови. Лабораторные показатели липидного обмена.
Образование и метаболизм желчных пигментов. Клинико-диагностическое значение исследования показателей пигментного обмена.
Аналитическая надежность и контроль качества клинических лабораторных исследований.
Аналитическая оценка лабораторных результатов. Виды ошибок, их характеристика.
Внутрилабораторный контроль качества. Методы контроля воспроизводимости результатов исследования. Контроль правильности результатов исследования.
C оставление аналитического лабораторного заключения.
Аналитическое лабораторное заключение составляется по условиям ситуационной задачи.
На основании их анализа предложенных лабораторных данных необходимо ответить на следующие вопросы:
Принцип, лежащий в основе анализируемого метода;
Необходимое оборудование;
Правила подготовки исследуемого материала и основные источники ошибок возможных при выполнении данного метода;
Единицы измерения;
Понятие о референтных значениях. Клинико-диагностическое значение анализируемого метода.
Практические навыки:
Организация рабочего места для выполнения лабораторных исследований;
Приготовление реагентов в необходимой концентрации;
Прием, маркировка и хранение биологического материала;
Выполнение общего анализа крови;
Выполнение общего анализа мочи;
Выполнение гемостазиологического исследования;
Выполнение биохимических исследований;
Оформение результатов лабораторных исследований;
